西藏冰川棘豆根内曲霉属真菌生物学特性研究

摘要：为探讨西藏植物内生菌曲霉属真菌的生物学特性，本研究利用PDA培养基和KB培养基鉴定了菌落的特征，利用载片培养法鉴定了孢子的特征。结果表明：①菌株在PDA培养基上菌落散生，边缘不规则缺裂，稀薄而透明，基部菌丝体薄且平坦、具沟纹、丝绒状质地；在KB培养基上菌落为黑色，边缘不规则缺裂，且形成有规则的褶皱，稀薄而透明，基部菌丝体薄、平坦、具沟纹、丝绒状质地。②所分离出的菌株不具有有性型。③分离得到的菌株属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目淡色孢科曲霉属环绕亚属黑色组真菌的一种。

关键词：冰川棘豆；半知菌；曲霉属

DOI:10.16249/j.cnki.54-1034/c.2015.01.007

中图分类号：U491.17

文献标识码：A　

文章编号：1005-5738(2015)01-035-04

收稿日期：2015-03-20

基金项目：2014年度西藏自治区大学生创新性实验训练计划项目“西藏八种药用植物内生菌的种类及生物多样性研究”阶段性成果，项目号：201410694003

第一作者简介：马红梅，女，汉族，甘肃武威人，西藏大学理学院讲师，主要研究方向为生物技术。

植物内生菌是植物微生态系统的重要组成部分，与植物有着协同进化和互惠互利的关系。植物内生菌能够产生活性物质，可作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业和医药卫生领域有着巨大的应用潜力。目前，国内已报道的在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属 [1]。西藏的植物资源有5000余种，大部分具有经济和药用价值，开展西藏植物内生菌的相关研究具有重要意义。

菌株的形态学特性研究是鉴定真菌最直接有效的方法，本实验研究通过从健康的西藏豆科植物冰川棘豆根内分离得到曲霉属真菌菌株，对其进行菌落形态和孢子形态的观察和实验，探讨西藏半知菌亚门丝孢纲丝孢目淡色孢科曲霉属环绕亚属黑色组真菌的生物学特性，进而为其药用价值研究奠定基础。

1　实验材料及仪器

1.1实验材料

实验材料为西藏豆科植物冰川棘豆植株，采自西藏自治区拉萨市达孜县邦堆乡叶巴村的山沟流石滩内，海拔3900m。

1.2实验仪器及试剂

接种箱、恒温培养箱、光学显微镜、医用手术刀、载玻片、玻璃平皿、医用消毒水、次氯酸钠及硫代硫酸钠

1.3培养基

PDA培养基：土豆，200g；葡萄糖，10g；琼脂，15g；蒸馏水，定容至1000ml。

改良型KB培养基 [2]：蛋白胨，10g；琼脂，20g；葡萄糖，10g；酵母膏，1g；硫酸镁，0.5g；磷酸二氢钾，1g；定容至1000ml。

2　实验方法

2.1样品处理及培养方法

取一定量的西藏豆科植物冰川棘豆根，用自来水将其反复清洗后，用医用消毒水清洗若干遍，再放入接种箱内紫外灭菌30min。取出后将植物根茎先切成长约4㎝左右的小节，然后再纵向切开放入盛有次氯酸钠溶液的烧杯中，10min后取出，依次用硫代硫酸钠、乙醇、无菌水冲洗 [3]，接入PDA培养基中，放入恒温培养箱中进行培养（培养温度为25℃），14d后得到黑色真菌菌落，转接到新的平皿中进行纯化。

2.2菌株及菌株孢子形态观察

将从西藏豆科植物冰川棘豆根内分离到的菌株分别接种于PDA培养基和改良型KB培养基上，观察其菌丝的生长状态、孢子的颜色以及PDA培养基和改良型KB培养基基质的颜色。待分离到的菌株充分生长后，选取少许以点接的方式，分别接入到配制好的PDA培养基和KB培养基中，放入恒温培养箱中进行培养（培养温度为25℃）；待观察到培养基表面菌丝刚开始生长时，用已消毒的医用手术刀切取长宽为2cm× 2cm的培养基转移至已灭菌的载玻片上，盖上盖玻片，放入温度为25℃、湿度为60%～80%的恒温箱内继续培养，在显微镜下每2d观察一次孢子的发育情况。

3　结果与分析

在25℃培养温度条件下，14d后发现西藏豆科植物冰川棘豆根内分离得到了黑色菌株，在PDA培养基上菌落形态为散生，边缘呈不规则缺裂，稀薄而透明，基部菌丝体薄、平坦、具沟纹、丝绒状质地；在KB培养基上菌落为黑色，边缘亦呈不规则缺裂，且形成有规则的褶皱，稀薄而透明，基部菌丝体薄、平坦、具沟纹、丝绒状质地。此菌株气生菌丝形成的梗茎不分枝、无色透明、表面光滑，长度为386μm，宽1.9μm；分生孢子呈头疏松状、黑色，平均直径为38μm（见图1C）。幼分生孢子头形成的梗茎呈无色透明、表面光滑，长度为7.4μm，宽度为0.65μm；幼分生孢子头呈直柱形，平均直径为7.3μm（见图2-F）。顶囊呈球形，可育表面具有梗基和瓶梗结构，梗基呈椭圆形，平均长度为1.94μm，宽度0.86μm；瓶梗呈椭圆形，平均长度为1.34μm，宽度0.75μm；分生孢子自瓶梗生出，形成了向基序列的不分支的分生孢子链，孢间联体明显，长度为0.33μm，宽度为0.61μm（见图2F、2G）；分生孢子为球形，表面有微刺，孢体呈黄色，平均直径为0.3μm（见图2E）。

4　讨论

本实验从健康的西藏豆科植物冰川棘豆根内分离得到了曲霉属真菌，宿主无任何病变的性状，经对其菌株及菌株孢子形态的观察测定，并参考《中国真菌志》（第五卷）中对真菌的分类，将该菌株归属于曲霉属环绕亚属黑色组真菌的一种 [4]，然而，此菌株在梗基和瓶梗形态上的描述与模式种有区别。在植物病原真菌超微形态中，将该菌株归类到半知菌亚门丝孢刚丝孢目淡色孢科曲霉属真菌的一种 [5]。在普通真菌学中，将该菌株归类到半知菌类丝孢刚丝孢目丛梗孢科曲霉属真菌的一种 [6]，在中国菌物中也将其归类到半知菌类丝孢刚丝孢目淡色孢科曲霉属真菌的一种 [7]。因此，本实验分离得到的菌株应属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目淡色孢科曲霉属环绕亚属黑色组真菌的一种。

参考文献

[1]胡桂萍,郑雪芳,尤民生,刘波.植物内生菌的研究进展[J],福建农业学报,2010,25(2):226-234.

[2]赫晓娟.植物内生菌[M].北京:中国农业科学出版社,2010:53-54.

[3][4]齐祖同.中国真菌志(第五卷)[M].北京:科学出版社,2003:5-9,76-91.

[5]康振生,黄丽丽,李金玉.植物病原真菌超微形态[M].北京:中国农业科学出版社,1997:111-113.

[6]邢来君,李明春,魏东盛.普通真菌学[M].北京:高等教育出版社,1999:388-389.

[7]林晓民,李振岐,侯军,王少先.中国菌物[M].北京:中国农业出版社,2007:265-268.

Study on biological characteristics of the Aspergillus separated from the roots of Oxyropis glacialis

Ma Hong-mei Liu Yi-xuan Hu Ling-ling

(School of Science, Tibet University, Lhasa 850000, Tibet)

Abstract: The biological characteristics of endophytic fungus belonging to Aspergillus separated from fresh roots of Oxyropi glacialis was studied and the characteristics of colonies and spores were identified by using photo cul⁃ture method with PDA medium and KB. The results showed that:①colonies of the strain were scattered, thin and transparent with irregular edges, thin and flat base mycelium with grooves and velvet-like texture on both PDA and KB medium, and colonies were black with regular folds on KB medium;②the isolated strain had no te⁃leomorph;③the isolated strain was one of the species of black fungus group belonging to Aspergillus, Monilia⁃ceous, Hyphomycetales, Hyphomycetes, Deuteromycotina.

Keywords: Oxyropis glacialis; Deuteromycotina; Aspergillus

[责任编辑：索郎桑姆]