古DNA(ancient DNA)是指从古代生物遗骸中得到的未降解的DNA分子片段。近年来，随着现代分子生物学的不断发展及实验技术的不断进步，古DNA研究已经广泛应用于考古学、人类学、生物学、遗传学等各领域，为考古发掘出的古代人物的身份鉴定、人类的演化迁徙、生物的起源进化、疾病的遗传流行等提供了分子生物学上的证据。长期以来，从牙、骨组织中提取DNA一直是人们获取古DNA的基本途径。牙齿的特殊解剖和组织学特征，为DNA提供了一个稳定的环境，成为古DNA研究中最理想的材料［1－3］。然而国内外报道的牙齿DNA的提取多是应用牙齿磨碎后的牙粉，这种方法极不利于考古标本的保存，特别是针对大样本量古DNA的研究。本研究旨在建立一种低损伤性古人类牙齿标本DNA的提取方法，并利用所获得的DNA进行性别鉴定。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

根管扩大针(COLORINOX－K型#15～#40，Dentsply，瑞士);根管扩大锉(COLORINOX－K型#15～#40，Dentsply，瑞士);微量紫外分光光度计(ND2000，NanoDrop，美国);PCR 仪(Veriti，Applied Biosystems，新加坡);电泳仪(PowerPac1000，BIO－RAD，美国);凝胶成像仪(Gel Doc XR，BIO－RAD，意大利);2×Taq PCR MasterMix(KT201－01，北京天根生化科技有限公司);20 bp DNA Ladder Marker(D521A，大连宝生物工程有限公司);DNA片段快速纯化试剂盒(XA014－2，北京鼎国生物技术有限责任公司)。

1.2 研究对象

本研究所采用的样本为:①陕西省考古所提供的出土于西安市长安区少陵原遗址的西周人牙齿7个，距今约3 000年;②陕西省考古所提供的出土于西安市长安区唐代居民遗址的唐代人牙齿1个，距今约1 000年;③本课题组收藏的现代人牙齿2个。所选样本均符合表面完整、无龋损、根尖部位完整的纳入标准(表1)。

表1 所选牙齿样本情况

编号 牙位 年代 距今年限 牙齿形态M28 D3 西周 约3 000年 完整M79 B1 西周 约3 000年 完整M148 C3 西周 约3 000年 完整M192 A2 西周 约3 000年 完整M207 B1 西周 约3 000年 完整M208 A1 西周 约3 000年 完整M328 A2 西周 约3 000年 完整T C3 唐代 约1 000年 完整N1 C4 现代 －完整N2 D4 现代 －完整

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集

将所有供试牙置1 mol/L盐酸中浸泡5～10 min，无菌双蒸水、无水乙醇依次清洗，自然晾干，紫外灯照射15 min后，用无菌根管扩大针、根管锉按从小到大的顺序依次从根尖孔逆向进入髓腔，轻轻锉磨根管壁，每个牙获得约5～10 mg牙髓组织和牙本质碎屑样品，收入1.5 mL无菌离心管备用。

1.3.2 DNA 提取和含量检测

分别取上述各牙所获样品5 mg置1.5 mL离心管中，加入200 μL 5%Chelex－100，2 μL 蛋白酶 k(10 mg/mL)，震荡 10 s;摇床 150 r/min，56 ℃ 恒温孵化12 h，震荡15 s;100℃水浴8 min，震荡15 s;12 000 r/min离心5 min，取上清液。用 NanoDrop 2000微量紫外分光光度计检测每个牙齿样品的DNA含量。

1.3.3 性别鉴定

1.3.3.1 PCR 扩增

PCR反应引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列［4］如下:上游引物(5'－CCC TGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG－3')，下游引物(5'－ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG－3');模板DNA为上述各牙所获样品的DNA提取液。

PCR反应体系为 25 μL，其中 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物(1 μmol/L)各1 μL，无菌双蒸水 9.5 μL，模板 DNA1 μL。

PCR反应参数:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 个循环;72℃延伸7 min。

1.3.3.2 凝胶电泳

制备浓度为4 g/L的琼脂糖凝胶，置1×TAE电泳缓冲液中，电泳条件为:电压100 V，电泳时间120 min。电泳结果放入Gel Doc XR凝胶成像仪观察。

1.3.3.3 纯化测序

将琼脂糖凝胶上的特异性条带切下，使用XA014－2型DNA片段快速纯化试剂盒进行纯化回收。测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

2 结果

2.1 各牙齿DNA提取液DNA含量

10个牙齿样本的DNA提取液浓度(表2)有一定差别，但总体来说DNA含量均较高，能够满足PCR扩增的要求。

表2 牙齿DNA紫外吸收值和DNA浓度

样本 A260 A280 260/280 浓度(ng/μL M28 0.485 0.363 1.33 24.2 M79 0.633 0.587 1.08 31.7 M148 2.256 1.800 1.25 112.8 M192 0.267 0.222 1.20 13.3 M207 0.372 0.351 1.06 18.6 M208 0.276 0.221 1.25 13.8 M328 0.308 0.251 1.23 15.4 T 0.348 0.275 1.27 17.4 N1 0.318 0.249 1.28 15.9 N2 2.604 2.184 1.19 130.2

2.2 电泳结果(图1～2)

图1 不同年代牙齿DNA经PCR扩增后电泳结果

M:marker;1:DNA提取过程阴性对照;2:PCR扩增过程阴性对照;3 ～7对应样品:M207、M328、T、N1、N2

图2 3 000年前牙齿DNA经PCR扩增后电泳结果

M:marker;1:DNA提取过程阴性对照;2:PCR扩增过程阴性对照;3 ～7对应样品:M28、M79、M148、M192、M208

5个样本均出现阳性特异性条带，其中样本N2条带较亮。在对样本残存牙髓组织和牙本质碎屑的收集过程中发现样本N2尚有成型的干尸状牙髓组织，而其他样本均为碎末状牙髓、牙本质混合组织，因此也说明含有较丰富细胞成分的牙髓组织比细胞成分含量较少的牙本质碎屑更容易提取到DNA片段。

图2为5个3 000年前牙齿样本PCR扩增产物的电泳结果，样本M79为分开的2条清晰条带，其他4个样本均为一条清晰条带。

2.3 性别分析

本研究的目的基因片段位于釉原蛋白基因(amelogenin)内含子1区，该区在X染色体上有6 bp的缺失，扩增X染色体特异性片段(AMELX)长度为106 bp，与其同源的Y染色体特异性片段(AMELY)为112 bp，因此男性样本的扩增产物有106 bp和112 bp两条电泳条带，而女性样本的扩增产物仅有106 bp一条电泳条带。该目的基因片段较短，是古DNA研究的理想基因，同时扩增产物具有性别多态性，可进行性别鉴定，在人类学和考古学中具有重要意义。

10个样本的扩增产物中除样本M79为2条带外其余9个样本均为一条清晰的条带，且所有条带均位于120 bp与100 bp之间，根据本研究目的片段的特点可以判定10个样本中除样本M79为男性外，其余9个样本均为女性。

同时，本研究所选的部分样本有出土后经体质人类学家所做出的性别鉴定结果(表3)，结合本研究结果可以更加完善样本信息。

表3 性别鉴定结果和对比

F表示女性，M表示男性，/表示未知

样本 PCR结果(条带)阴性对照 基因性别鉴定 体质性别鉴定M281－FF M792－MM M1481－F/M1921－FF M2071－F/M2081－F/M3281－F/T 1－F/N11－F/N21－F/

2.4 测序结果

通过对样本M28和样本M79扩增产物的测序，确定样本M28和样本M79分子量较小的一条带位于X染色体上釉原蛋白基因内含子1区(3 462～3 567)，长度106 bp，样本M79分子量较大的一条带位于Y染色体上釉原蛋白基因内含子1区(4 070～4 181)，长度112 bp。

3 讨论

釉质的主要成分是羟磷灰石晶体，其硬度约为洛氏硬度值(Knoop hardness number，KHN)340，相当于牙本质硬度(70KHN)的5倍，是人体中最硬的组织［5］。在考古发掘出的古人类遗骸中，牙齿是保存最完整的人体组织。同时，牙髓腔是一个密闭的结构，除根尖孔外不与外界环境相通，避免了环境变化对古DNA的影响，也减少了古DNA受污染的机会［6］。然而，传统的从牙齿中提取DNA的方法是将牙齿进行表面的去污染处理后用液氮研磨机将其研磨成牙粉以备DNA的提取。这种方法虽然能够最大限度的提取基因组DNA，但完全破坏了牙齿的形态学结构，因此是考古学家和体质人类学家所不能接受的。本研究采用Cobb［7］于2002年提出的“逆向根管技术”，即在不破坏牙齿表面结构的情况下，从根尖孔逆向进入牙髓腔提取残存牙髓组织和牙本质碎屑，最大限度的减小了古代标本的破坏。

有机酚法是古DNA提取的经典方法，但该方法在沉淀DNA时一些色素物质与DNA一起共沉淀，这些色素物质是PCR反应中的关键酶——热稳定性DNA聚合酶的强力抑制剂，不利于古DNA的扩增［8］。近年来一种基于商业化的试剂盒广泛应用于古DNA的提取，这些试剂盒操作简单规范，是古DNA提取的理想方法，但对于大样本量的古DNA筛查成本略高。Chelex－100是一种金属离子螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，其悬液在碱性环境(pH 10～11)和100℃的条件下，可导致细胞膜的破裂和DNA的变性并释放出来［9］;同时其所含的成对亚氨基二乙酸盐离子起着螯合基团的作用，对多价的金属离子具有极强的亲和力，能与Mg2+、Ca2+等核酸反应必需的二价金属阳离子螯合，从而防止DNA降解，提高PCR扩增成功率。此外，Chelex－100不仅成本低廉，而且操作简便，只在一个离心管中即可完成整个DNA提取过程，大大减小了DNA提取过程中受污染的机会，极适合大样本量古DNA的提取。

本研究应用“逆向根管技术”和Chelex－100提取法相结合的方法成功从3 000年前人牙齿中提取出基因组DNA，不仅较大程度的保证了古人类牙齿的外形完整，同时所提取到的基因组DNA分子含量较高，可用于PCR扩增技术相关的性别鉴定。本方法操作简便，成本低廉，安全有效，对古人类牙齿DNA的提取和研究有一定的指导意义。

参考文献:

［1］Ginther C，Issel－Tarver L，King MC.Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth［J］.Nat Genet，1992，2(2):135－138.

［2］Merriwether DA，Rothhammer F，Ferrell RE.Genetic variation in the New World:ancient teeth，bone，and tissue as sources of DNA［J］.Experientia，1994，50(6):592－ 601.

［3］Mac Hugh DE，Edwards CJ，Bailey JF，et al.The extraction and analysis of ancient DNA from bone and teeth:a survey of current met hodologies［J］.Anc Biomol，2000，3(3):81 －103.

［4］Sullivan KM，Mannucei A，Kimpton CP，et al.A rapid and quantitative DNA sex test:fluorescence－based PCR analysis of X－Y homologous gene amelogenin［J］.Biotechniques，1993，15(4):636－641.

［5］于世凤.口腔组织病理学［M］.5版.北京:人民卫生出版社，2003:41－43.

［6］施琳，曾祥龙.古人类牙齿DNA的提取和研究［J］.口腔正畸学，2006，13(4):194－196.

［7］Janice C.Cobb.Ancient DNA recovered by a non destructive method［J］.Anc Biomol，2002，4(4):169 －172.

［8］蔡胜和，杨焕明.方兴未艾的古代DNA研究［J］.遗传，2000，22(1):41－46.

［9］Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R.Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR－based typing from forensic material［J］.Biotechniques，1991，10(4):506－513.