【类型】期刊

【作者】邢婷婷，刘勇勤，王宁练，沈亮，顾政权，郭泌汐（中国科学院青藏高原研究所高寒生态学与生物多样性重点实验室；中国科学院青藏高原地球科学卓越中心；中国科学院青藏高原研究所青藏高原环境变化与地表过程重点实验室；中国科学院寒区旱区环境与工程研究所冰冻圈科学国家重点实验室）

【作者单位】中国科学院青藏高原研究所高寒生态学与生物多样性重点实验室；中国科学院青藏高原地球科学卓越中心；中国科学院青藏高原研究所青藏高原环境变化与地表过程重点实验室；中国科学院寒区旱区环境与工程研究所冰冻圈科学国家重点实验室

【刊名】冰川冻土

【关键词】 冰川微生物；温度；盐度；pH

【资助项】国家自然科学基金项目

【ISSN号】1000-0240

【页码】P528-538

【年份】2019

【期号】第2期

【期刊卷】1;|7;|8;|2

【摘要】为了解冰川微生物生长特点,分析了青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川和扎当冰川可培养细菌在不同温度,及木孜塔格冰川可培养细菌在不同盐度和p H下的生长特性.木孜塔格冰川52%的可培养细菌不耐盐,只能在0%盐度下生长,38%的细菌可以在0%~4%/6%盐度培养基中生长,其余细菌可以在0%~1%/2%的盐度培养基中生长,且62%的细菌具有较广的p H值生长范围(p H 5~9);另外,38%的细菌只能在弱酸性(5%)或者只能在弱碱性(33%)培养基中生长.3个冰川可培养细菌生长温度范围均为0~35℃,木孜塔格冰川最适生长温度≤20℃的细菌占其细菌总数的86%,而玉珠峰冰川和扎当冰川最适生长温度≤20℃的细菌则分别占其细菌总数的69%和53%.不同冰川具有不同最适生长温度的细菌的比例不同,同一冰川不同深度相同属类的细菌有相近的生长温度特征、耐盐度和耐酸碱特征.

【全文】 文献传递

青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川可培养细菌的生理特征

邢婷婷1，刘勇勤2，3，王宁练2，4，沈　亮1，顾政权1，郭泌汐1

（1.中国科学院青藏高原研究所高寒生态学与生物多样性重点实验室，北京100101；2.中国科学院青藏高原地球科学卓越中心，北京100101；3.中国科学院青藏高原研究所青藏高原环境变化与地表过程重点实验室，北京100101；4.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所冰冻圈科学国家重点实验室，甘肃兰州730000）

摘　要：为了解冰川微生物生长特点，分析了青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川和扎当冰川可培养细菌在不同温度，及木孜塔格冰川可培养细菌在不同盐度和pH下的生长特性.木孜塔格冰川52%的可培养细菌不耐盐，只能在0%盐度下生长，38%的细菌可以在0%～4%/6%盐度培养基中生长，其余细菌可以在0%～1%/2%的盐度培养基中生长，且62%的细菌具有较广的pH值生长范围（pH 5～9）；另外，38%的细菌只能在弱酸性（5%）或者只能在弱碱性（33%）培养基中生长.3个冰川可培养细菌生长温度范围均为0～35℃，木孜塔格冰川最适生长温度≤20℃的细菌占其细菌总数的86%，而玉珠峰冰川和扎当冰川最适生长温度≤20℃的细菌则分别占其细菌总数的69%和53%.不同冰川具有不同最适生长温度的细菌的比例不同，同一冰川不同深度相同属类的细菌有相近的生长温度特征、耐盐度和耐酸碱特征.

关键词：冰川微生物；温度；盐度；pH

doi：10.7522/j.issn.1000-0240.2016.0059

Xing Tingting，Liu Yongqin，Wang Ninglian，et al.The physiological characteristics of culturable bacteria in Muztag、Yuzhufeng and Zadang glaciers on Tibetan Plateau，China［J］.Journal of Glaciology and Geocryology，2016，38（2）：528-538.［邢婷婷，刘勇勤，王宁练，等.青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川可培养细菌的生理特征［J］.冰川冻土，2016，38（2）：528-538.］

0　引言

冰川按年代顺序层层保存了大量微生物，是保存过去微生物的良好载体，也是连接古代与现代环境的纽带［1-2］.长期贮存在冰川中的细菌，在自然选择的作用下形成独特的低温适应机制，如产生低温酶、抗冻剂、维持细胞膜稳定性与流动性的不饱和脂肪酸等［3］.研究冰川微生物有利于发掘新基因，丰富微生物多样性，揭示过去环境的变迁以及生物进化乃至生命的进化规律，同时也有助于了解微生物对全球气候变化的反馈［4］.

我国是中、低纬度地区冰川最发育的国家，其主体是青藏高原冰川［5］.青藏高原平均海拔4 000 m以上，其冰川主要集中分布在昆仑山、喜马拉雅山和喀喇昆仑山［6］.对青藏高原冰川微生物的研究发现，不同冰川发育不同的微生物种群［7］，珠穆朗玛峰北坡海拔6 600～8 000 m表层雪中细菌的优势种群是β-Proteobacteria和Actinobacteria；马兰冰芯细菌优势种群是α-、β-及γ-Proteobacteria、Cytophage-Flexibacter-Bacterioides（CFB）；慕士塔格浅冰芯细菌优势种群是α-、γ-Proteobacteria及High G+C gram-positive bacteria（HGC）［8-10］等.此外，不同季节冰川细菌数量和多样性不同，夏季雪中细菌多样性高于冬季，夏季细菌种类多与海洋环境相关，而冬季细菌则具有更强的耐冷性［11-12］.这些研究揭示了青藏高原冰川微生物群落多样性、数量分布特征及其与气候环境的关系［9-10，13］.但对青藏高原冰川可培养细菌的生理特征的研究较少，对不同冰川可培养细菌的生长温度范围和最适生长温度缺乏对比研究，对其在不同盐度和pH下的生长特点更是少有报道，而这些最基本的生理特征是揭示冰川微生物适应冰川环境及其对气候环境响应机制的基础.

本研究选取青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川（图1）中的可培养细菌，对比研究了3个冰川共81株可培养细菌在不同温度下的生长特性，及木孜塔格冰川21株可培养细菌在不同盐度和pH下的生长特性，以期初步揭示不同冰川可培养细菌的生理特征.

1　材料和方法

1.1　样品的采集和处理

木孜塔格冰川（36.4°N，87.3°E）位于青藏高原西北部昆仑山主脊，海拔6 973 m，降水量少、气候干燥、辐射强烈，属于大陆型冰川［14-15］.玉珠峰冰川（35.5°N，94.2°E）位于高原北部东昆仑地区，海拔6 178 m，气候寒冷干旱［16］.扎当冰川（30.5°N，90.6°E）位于念青唐古拉山主峰的东北坡，属于大陆型冰川，冰川区降水主要来自夏季西南季风和局地对流云系［17］，最高海拔6 090 m，末端海拔5 515 m.这三个冰川分别位于不同的自然地理带且受不同的大气环流影响，其中，木孜塔格冰川处于高寒荒漠带，主要受西风环流的影响［14］，年平均温度-4℃；玉珠峰冰川位于青藏高原北部的高寒草甸带，主要受西风的影响［16］，年平均温度-5℃；扎当冰川位于青藏高原中部高寒草甸带，春季主要受西风影响，但夏季受到印度季风的影响更为明显，年平均气温-3.4℃［18］.

玉珠峰冰芯和木孜塔格冰芯分别于2007年和2012年钻取，冰芯样品在中国科学院寒区与旱区环境与工程研究所国家冰冻圈实验室冷库内处理，按5 cm间隔切取冰芯样品，在-20℃超净实验室用灭菌的手术刀切除外层约2 mm的一层，将手术刀在酒精灯上灼烧灭菌后再刮去约2 mm的一层，将切好的冰芯样品放在洁净灭菌的Nalgene瓶中于4℃消融.

雪坑样品的采集是在雪坑剖面每隔10 cm采集微生物雪样，分装入1 L洁净灭菌的Nalgene瓶中，在野外及运输过程中样品一直处于冷冻状态保存.整个过程穿戴洁净无菌服进行所有操作.

1.2　可培养细菌的分离和培养

取冰芯、冰雪融水200 μL涂布于寡营养固体培养基R2A表面，R2A培养基成分为1 L液体培养基中含酵母提取物0.5 g、蛋白胨0.5 g、酸水解酪素0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、丙酮酸钠0.3 g、磷酸氢二钾0.3 g、七水硫酸镁0.05 g，调节pH至7.2.R2A固体培养基，是上述1 L培养基中加入15 g琼脂.

4℃培养2～6个月后，挑选平板纯化单菌落，选用通用引物27F和1492R做PCR，进行16S rRNA测序，将得到的所有序列用Blast软件在GenBank数据库进行相似性搜索，获取相近典型菌株的16S rRNA基因序列.同时，将纯化后的单菌落置于液体R2A培养基中，并在200 r·min-1摇床上培养观察，制成原液备用.

1.3　不同温度可培养细菌生理实验

选取木孜塔格冰川、玉珠峰冰川和扎当冰川共81株细菌进行不同温度下的培养（表1）.将50 μL细菌原液加入到5 mL R2A液体培养基中，每个样品3个平行样，然后将试管置于不同温度恒温培养箱中培养20 d，振荡均匀测量OD600.不同培养温度设置为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃.

1.4　不同盐度可培养细菌生理实验

对木孜塔格冰川21株细菌进行了不同盐度培养（表2）.在液体R2A培养基中加入NaCl，使得培养基中盐度值（w/v）分别为1%、2%、3%、4%、5%和6%.将50 μL细菌原液加入到5 mL不同盐度的培养基中，每个样品3个平行样.其中，用于新种鉴定的菌株（B555、B1472、B1555、B1789、B2974）在其最适温度下培养，其余细菌均在室温（18～20℃）下静置培养20 d，振荡均匀测量OD600.

1.5　不同pH可培养细菌生理实验

对木孜塔格冰川21株细菌进行了不同pH培养（表3）.在液体R2A培养基中加入HCl或者NaOH，使用Sartorius PB-10 pH仪来调节培养基pH，确保培养基的pH分别为5、6、7、8、9、10 和11.pH培养基的配制是先灭菌后调节pH，而后将50 μL细菌原液加入到不同pH值的培养基.其中，用于新种鉴定的菌株（B555、B1472、B1555、B1789、B2974）在其最适温度下培养，其余细菌均在室温（18～20℃）静置培养20 d，振荡均匀测量OD600.

1.6　细菌生长浓度测定

本实验采用光电比浊法测定细菌生长浓度，选取可见光600 nm波段处测定每个试管中培养液的吸光度值.首先，每个试管取200 μL菌液加入到96孔细胞培养板（96 Well Cell Culture Cluster），利用多功能酶标仪（SpectraMax M5 Molecular Devices），选取600 nm波段处进行光电比浊测定OD值.

2　分析结果

2.1　冰川可培养细菌在不同温度下的生长

木孜塔格冰川可培养细菌的生长温度范围为0 ～35℃（表1），其中，18株细菌的最适生长温度≤20℃，占86%，最适生长温度最高为25℃（图2a）.玉珠峰冰川可培养细菌生长温度范围为0～ 35℃，39株细菌中27株细菌最适生长温度≤20℃，占69%，最适生长温度最高为35℃（图2b）.扎当冰川21株可培养细菌的生长温度范围为0～35℃，最适生长温度≤20℃的细菌占52%，最适生长温度最高为35℃（图2c）.此外，玉珠峰冰川可以在0℃生长的细菌占其总数的94%，而木孜塔格和扎当冰川在0℃可以生长的细菌数量均占其总数的38%.木孜塔格冰川可培养细菌最低生长温度为0℃、10℃和15℃的细菌分别占38%、48%和14%；玉珠峰冰川可培养细菌最低生长温度为0℃、5℃和10℃的细菌分别占94%、3%和3%；扎当冰川可培养细菌最低生长温度为0℃、5℃、10℃和15℃的细菌分别占38%、10%、38%和14%.

2.2　冰川可培养细菌在不同盐度下的生长

木孜塔格冰川可培养细菌不同盐度培养结果显示（表2），52%的细菌不耐盐，只能在0%的盐度下生长；10%的细菌生长盐度范围分别为0%～1%/ 2%；38%的细菌可以在0%～4%/6%的盐度培养基中生长.Actinobacteria门Agreia属和Chryseoglobus 属2株细菌以及α-Proteobacteria门Aureimonas属的6株细菌具有较高的耐盐度.

2.3　冰川可培养细菌在不同pH下的生长

木孜塔格冰川可培养细菌不同pH培养结果显示（表3），只可以在弱碱性培养基（pH为7～9/10）中生长的细菌占33%；5%的细菌只能在弱酸性培养基（pH为5～7）中生长；62%的细菌具有较广的生长pH范围（pH为5～9/10）.相同属类的细菌有着相近的生长pH范围和最适pH，如α-Proteobacteria门Aureimonas属的6株可培养细菌生长pH范围为5～10，而最适生长pH都为5或者6.

3　讨论

青藏高原冰川可培养细菌具有较广的温度适应性，生长范围从0～35℃.低温环境中的细菌一般有两类：一类是必须生活在低温环境下且最高生长温度不超过20℃，最适生长温度在15℃，在0℃可以生长繁殖的嗜冷菌；另一类是最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃可生长繁殖的耐冷菌［19］.对青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川和扎当冰川可培养细菌生长温度范围和最适生长温度的研究表明，81株实验菌株均为耐冷菌.已有研究证明，青藏高原冰川可培养细菌以耐冷菌为主，如向述荣等［11］对慕士塔格冰芯可培养细菌的研究发现冰芯菌大多数属于耐冷菌和嗜温菌，并且这些嗜温菌可以在-2℃的低温环境中生长；张淑红等［20］采自老虎沟冰川细菌也为耐冷菌.冰川细菌从常温环境被运送并储存在冰川后，细菌会降低最低生长温度和最适生长温度，进化为耐冷菌适应冰川寒冷环境，但这些细菌仍然保留了在常温环境下生长的能力［21］.耐冷菌在冰川的低温环境中具有更强的竞争力，冰川微生物是环境选择和生物适应的结果［11］.Counnot［22］的研究也证明，冰川低温环境有利于低温菌的生长.木孜塔格冰川中大部分可培养细菌最适生长温度明显低于玉珠峰冰川和扎当冰川（图2），可能是因为木孜塔格冰川海拔最高，且温度最低，较低的冰川温度使得冰川细菌具有更低的最适生长温度，进一步说明不同的冰川环境对细菌的选择作用.此外，冰芯压力高于雪坑，雪坑温度略高于冰芯，随着深度的增加雪坑中Ca2+、Mg2+浓度呈现不同变化趋势［23-24］，从雪坑到冰芯，经过低温环境的筛选得到能够适应寒冷环境的细菌.

冰川细菌与分离于冰冻圈外的细菌的最低生长温度和最适生长温度明显不同，如分离于玉珠峰冰川的Lysobacter属（γ-Proteobacter门）的细菌共19株，其温度生长范围为0～35℃，最适生长温度10～20℃居多（68%），最低生长温度为0℃；但分离于土壤和水中的Lysobacter属细菌温度生长范围4～37℃，最适生长温度为20～30℃，最低生长温度4℃［25］.另外，分离于木孜塔格冰川的Massilia属（β-Proteobacteria）的3株细菌B528、B1100和 B1555，其温度生长范围分别是0～25℃、0～ 20℃和0～25℃，最适生长温度均是15℃；但分离于空气、土壤、水或者其他环境的Massilia属的细菌的温度生长范围为4～55℃，最适生长温度为28～30℃，最低生长温度为4℃［26-29］.与此相似的还有Polaromonas属（β-Proteobacteria）的细菌，分离于常温环境（土壤，自来水等）的细菌的最适生长温度为20℃左右，最低生长温度为4℃；而分离冰雪的Polaromonas属的细菌最适生长温度为15℃，最低生长温度为0℃［30-35］.冰川细菌相比较常温环境的细菌具有更低的最适生长温度和最低生长温度.

可培养细菌的最适生长温度并没有随着深度的增加而减小或降低.通过分析冰芯不同深度可培养细菌的生长温度范围和最适生长温度的关系发现，二者并无明显关系并呈现波动分布（图3）.玉珠峰冰芯钻孔温度在5～25 m呈现递减趋势［36］，但是在该部分分离的细菌的最适生长温度却没有出现相同的趋势.向述荣等［10］对慕士塔格冰芯不同深度可培养细菌温度培养结果也发现，细菌温度生长范围和最适生长温度与深度无明显线性关系.同一冰芯不同深度相同属的细菌具有相近的生长温度范围和最适生长温度，造成细菌生长温度特征差异的主要因素是细菌属类，深度与细菌生长温度范围和最适生长温度无明显关系.这可能是因为不同属类细菌结构存在差异，适应环境能力不同，从而造成生长温度特征不同.

木孜塔格冰川38%的可培养细菌可以在0%～ 4%/6%的广盐度范围内生长（表2），NaCl主要通过影响细胞的渗透压和营养盐的吸收，不同盐度会导致细胞过度伸缩或舒张从而造成细胞死亡，不同细菌对盐度渗透压的适应能力不同［37-38］.之前对微生物耐盐度的研究主要集中于海洋细菌，其能分泌耐盐酶，合成、释放无机离子或合成渗压剂（如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等）来适应海洋高盐度环境［39-40］.对青藏高原湖底沉积物中细菌群落的研究表明，盐度与微生物群落分类无显著性关系，随着盐度的升高，可培养细菌的丰度降低［41］.与本实验研究一致，在盐度为3%左右时62%冰川可培养细菌不能生长.不同属类的细菌耐盐度存在差异，与不同分类的细菌对盐度渗透压的适应能力不同是一致的［37］.

木孜塔格冰川可培养细菌可以在pH 5～9/10的范围内生长的细菌占62%，33%的细菌可以在弱碱性培养基中生长，剩余5%的细菌只能在弱酸性培养基中生长（表3）.pH对微生物的影响主要是通过以下两个方面来实现：一是通过影响生物大分子的电荷影响生物活性；二是引起细胞膜电荷变化导致微生物吸收营养物质的能力改变［42］.李向应等［43］对青藏高原雪坑和冰芯研究发现雪坑和冰芯呈现弱酸、弱碱性不等；而对天山冰川融水的pH研究得出，从降水到表层雪再到雪坑样品，pH呈现减小的趋势［44］.尚天翠等［45］研究发现，慕士塔格细菌在中性或者酸性环境下生长良好，这与慕士塔格冰芯融水弱酸环境（pH=5.2）是一致的.相同属的细菌的耐酸碱范围相似，冰川酸碱度会对细菌的生长产生影响.

4　结论

青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川共81株可培养细菌有以下生理特征：木孜塔格、玉珠峰及扎当冰川的可培养细菌都是耐冷菌，均具有较广的生长温度范围；冰川细菌具有较低的最低生长温度和最适生长温度.不同冰川细菌最适生长温度存在差异，同一冰川相同属的细菌温度生长特征相近.木孜塔格冰川可培养细菌耐盐度较低，相同属的细菌耐盐度相似，且木孜塔格冰川可培养细菌一般可以在弱酸、弱碱性培养基中生长.

青藏高原不同冰川可培养细菌具有多样性的生理特征，这些特征一方面说明了冰雪细菌来源于多种环境，另一方面也说明了冰川对细菌的选择作用.青藏高原冰川微生物“储存”在冰雪中，在寒冷环境中仍保持一定的代谢活性，研究其温度、盐度及pH生长特征，为我们后续研究冰雪微生物的代谢途径做好铺垫，也有助于我们更好了解极端环境下微生物的适应机制，进而更好地通过冰川微生物构建还原“古气候”.

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The physiological characteristics of culturable bacteria in Muztag、Yuzhufeng and Zadang Glaciers on Tibetan Plateau，China

XING Tingting1，LIU Yongqin2，3，WANG Ninglian2，4，SHEN Liang1，GU Zhengquan1，GUO Bixi1
（1.Key Laboratory of Alpine Ecology and Biodiversity，Institute of Tibetan Plateau Research，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China；2.Center for Excellence in Tibetan Plateau Earth Sciences of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China；3.Key Laboratory of Tibetan Environment Changes and Land Surface Processes，Institute of Tibetan Plateau Research，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China；4.State Key Laboratory of Cryospheric Sciences，Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute，Lanzhou 730000，China）

Abstract：In order to reveal the characteristics of glacier-microorganism，we assayed the culturable bacteria isolated from Muztag Glacier，Yuzhufeng Glacier and Zadang Glacier at different temperatures.Besides，culturable bacteria isolated from Muztag Glacier was observed at different salinity and pH.Salinity endurance of 52%of Muztag Glacier culturable bacteria was 0%，and 38%bacteria could grow in the medium of NaCl density with 0%～4%/6%，while the other bacterial salinity tolerance range was 0%～1%/2%.Muztag Glacier culturable bacteria had wide range pH tolerance（5～9）occurring 62%，while bacteria only grew in weak acid（5%）or weak alkaline（33%）medium accounting for 38%.Growth-temperature range of bacteria in these three glaciers was 0 ～35℃.The Muztag bacterial optimum temperature which was below 20℃（including 20℃）accounted for 86%，while Yuzhufeng Glacier and Zadang Glacier were 69%and 53%，respectively.The percent of different optimum temperatures in different glaciers were different.Culturable bacteria belonged to one genus isolated from same glacier had similar growth-temperature range，salinity and pH tolerance in different depths.

Key words：glacier microorganism；temperature；NaCl；pH

中图分类号：Q935

文献标志码：A

文章编号：1000-0240（2016）02-0528-11

收稿日期：2015-12-28；

修订日期：2016-03-08

基金项目：国家自然科学基金项目（41425004；41190084；41371084）资助

作者简介：邢婷婷（1989-），女，山西临汾人，2014年毕业于中国地质大学（武汉），现为中国科学院青藏高原研究所在读硕士研究生，主要从事冰芯微生物研究.E-mail：xingtingting@itpcas.ac.cn

*通讯作者：刘勇勤，E-mail：yqliu@itpcas.ac.cn.