CD44是一种细胞膜整合糖蛋白，在很多肿瘤组织及细胞中表达上调，在胃癌细胞中CD44表达明显高于正常细胞[1,2]，可能作为胃癌的生物标记分子[3,4]。噬菌体展示技术是一种简便、有效、快速、廉价的获得分子多肽受体配体的技术[5,6]。多肽分子经标记后成为一类分子探针，可应用于分子成像技术，对肿瘤进行早期诊断及治疗效果评价[7,8] 。2016年2月～2017年12月，我们通过噬菌体展示技术针对胃癌高表达的CD44分子进行亲和力筛选，旨在获得胃癌靶向性多肽探针，以期为胃癌的早期诊断提供方法。

1 材料

人胚肾细胞株HEK293(本校实验室提供、贮存)。噬菌体展示肽库：噬菌体展示随机十二肽文库，购自New England Biolabs(美国)，标识滴度为1.5×1013 pfu/mL，总量100 μL，贮存于含50%甘油的TBS缓冲液中。宿主菌：E.coli ER2738购自New England Biolabs(美国)，以含50%甘油的菌体培养物形式贮存于- 80 ℃冰箱。M13噬菌体-96gⅢ引物：引物序列为5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′，购自New England Biolabs(美国)。胎牛血清蛋白(BSA)购自Amresco公司(美国)。

2 方法与结果

2.1 噬菌体展示随机十二肽文库滴度测定 使用噬菌体展示随机十二肽文库，稀释度为1×10-8的培养板噬菌斑数量约为120个，根据噬菌体滴度=(噬菌斑数目×稀释倍数)pfu/10 μL，计算噬菌体展示随机十二肽文库的滴度约为1.2×1011 pfu/10 μL。

2.2 以CD44纯化蛋白为靶点筛选亲和力多肽 将CD44纯化蛋白固定固相表面(酶标板)作为靶点，利用噬菌体展示随机十二肽文库首先与包被有BSA的阴性孔结合，吸走上清后，上清再与包被有CD44纯化蛋白的阳性孔结合，做消减筛选，以尽量去除随机多肽库中能与BSA结合的克隆，减少非特异性吸附，增加筛选的特异性和亲和力。根据2.1得到的滴度，每轮筛选投入病毒子数量必须稳定在1.0×1011，因此首轮投入噬菌体10 μL，每轮筛选后滴定洗脱物滴度，扩增洗脱物后滴定扩增物滴度，并计算每轮产出/投入比，以观察每轮筛选的富集，作为筛选是否成功的一个参考参数(正常情况下，一个成功的筛选会出现优势克隆的富集)。4轮筛选的投入、产出、产出/投入情况见表1。第1、2、3、4轮富集倍数分别为1倍、1.45、11.4、896倍。

2.3 从最终洗脱库中挑选克隆并测序 经过四轮亲和力筛选，最终从第4轮的洗脱物中，通过涂板挑单克隆的方法随机挑选出30个噬菌体单克隆(P1～P30)。随后对这些克隆进行扩增并提取单链DNA模板，将模板样本及测序引物进行全自动测序(苏州金唯治生物科技有限公司)。根据噬菌体展示随机十二肽文库试剂盒附带使用手册读序图，使用Bioedit查看测序图谱，寻找随机肽编码DNA序列插入点两端限制性内切酶KpnⅠ酶切位点GGTACC和EgalⅠ酶切位点CGGCCG，十二肽序列编码DNA序列插入上述两个酶切位点之间，读取插入序列后，利用DNAStar软件将插入序列的碱基序列翻译为氨基酸序列。

结果显示，噬菌体克隆P1、P2、P5、P8、P9、P12、P14、P18、P20、P23、P27、P28具有相同序列，测序并手工翻译多肽序列为Trp His Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Thr Gln Gln Ala(简写为WHXXXXXXQQA)；噬菌体克隆P4、P7、P10、P16、P19、P21、P26、P30具有相同序列，测序并手工翻译多肽序列为Thr Leu Trp His Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Xxx Met Arg(简写为TLWHXXXXXXMR)；噬菌体克隆P6、P11具有相同序列，测序并手工翻译多肽序列为Trp His Asn Ser Tyr Trp Tyr Trp Pro Val Met Arg(简写为WHNSYWYWPVMR)；噬菌体克隆P22序列，测序并手工翻译多肽序列为Ser Tyr His Thr His Pro His Ala Gly Pro Pro Phe(简写为SYHTHPHAGPPF)；噬菌体克隆P3、P13、P24具有相同序列，测序并手工翻译多肽序列为Glu Tyr Ser Pro Val Tyr Ala Pro Thr His Gln Gly(简写为EYSPVYAPTHQG)；噬菌体克隆P25序列，测序并手工翻译多肽序列为His Trp Ser Trp Trp Tyr Thr Phe Asn His Thr Pro(简写为HWSWWYTFNHTP)；噬菌体克隆P15、P17、P29具有相同序列，测序并手工翻译多肽序列为Asn Asn His Ala Gly Gln Lle Met Val His Lys Tyr(简写为NNHAGQIMVHKY)。

综合30个噬菌体克隆的测序结果，可以获得7条多肽序列，分别为S1(WHXXXXWTQQA)、S2(TLWHXXXXPAMR)、S3(WHNSYWYWPVMR)、S4(SYHTHPHAGPPF)、S5(EYSPVYAPTHQG)、S6(HWSWWYTFNHTP)、S7(NNHAGQIMVHKY)。其中S1重复12次，S2重复8次，S5、S7重复3次，S3重复2次，S4、S6出现1次。通过ClustalX软件和人工均可发现S1和S2之间同源性较高，S1和S2存在共有6肽基序(Motif)WHXXXX(其中X表示该位氨基酸保密，X位氨基酸可变，经分析在S1和S2中该位均为亲水性氨基酸)。见表2。

2.4 多肽序列噬菌体克隆与CD44的亲和力检测 采用ELISA法。对上述7个多肽序列的代表噬菌体克隆，在ELISA板上设阳性孔3个，包被CD44纯化蛋白，阴性孔3个，包被BSA，并用野生型作为对照，以检测各个噬菌体克隆对BSA包被酶标板的结合情况，并排除假阳性克隆。以阳性OD490/阴性OD490>2.5作为判断阳性克隆的标准，最终挑选出S1、S2、S5、S7四个阳性克隆，其阳性OD490/阴性OD490分别为6.61、3.36、3.24、3.10，其中S1初步鉴定为亲和力最高的克隆。见表3。

2.5 阳性噬菌体克隆的靶向性检测 采用免疫荧光法。通过GV146-CD44质粒转染HEK1293细胞获得膜表达的CD44，以GV146空质粒转染的HEK293细胞作为阴性对照，最终确定S1-WHXXXXXXQQA对CD44的亲和力和特异性最好。

3 讨论

噬菌体展示随机多肽库是一种快速简便的筛选分子亲和短肽配体的方法，其筛选出的短肽对靶分子具有良好的亲和力和特异性[9]。多肽探针可人工合成，具有相对分子质量小、稳定性佳、活性好、生物穿透力强、亲和力与特异性高、免疫原性低、毒性低等优点[10,11]。本研究结合肿瘤的分子生物学特征和影像学进展，旨在通过噬菌体展示技术针对胃癌高表达的CD44分子进行亲和力筛选，以获得胃癌靶向性多肽探针[12]，利用该分子探针进行分子影像学成像，有望提高传统影像学手段对早期胃癌的检出率[13,14]。

首先，我们使用噬菌体十二肽库以CD44纯化蛋白为靶点进行四轮亲和力筛选，对每轮筛选的洗脱物进行滴度测定。结果显示，随着筛选轮次的递增，富集倍数亦递增。经过四轮筛选，从最终洗脱物中我们随机挑选30个克隆进行测序，这些噬菌体克隆共有7个展示多肽序列，其中序列S1、S2分别重复出现12次和8次，并且两者拥有共同六肽基序WHXXXX(其中X氨基酸可变，而可变位经分析均为亲水性氨基酸)，因此基序WHXXXX出现频率达20/30。随后，我们对这些序列进行生物信息学分析，发现基序WHXXXX与已知蛋白kiSS-1 receptor有较高同源性[15]。我们进一步利用GV146-CD44质粒转染HEK293细胞使其高表达CD44，以其为靶点利用噬菌体随机肽库进行筛选。CD44分子通过质粒转染细胞，这种结合类似于抗原、抗体结合。此时CD44分子处于膜整合状态，其结构与在正常及肿瘤细胞中表达的CD44完全相同，是适合筛选的最理想状态[16,17]。但这种方法仍然存在缺陷，因为细胞膜虽然保持了蛋白质的天然结构，但细胞膜上的其他成分也同时干扰了筛选的特异性[18]。从研究结果来看，固相筛选虽然简单并可能影响蛋白分子的天然结构，但在一些情况下与细胞筛选相比并不一定处于劣势。另外，国外亦有研究者尝试通过将蛋白分子体外表达到一种纳米级磷脂双分子层上以结合固相筛选法和细胞筛选法各自的优势，亦取得较好的筛选效果[19]。因此，为了获得更具实用价值、亲和力及特异性更好的靶向短肽，需要更多的具有创新性的筛选方法。

对S1与S2拥有的共同序列WHXXXX通过软件与CD44透明质酸结合域进行分子对接中发现[20]，该基序确实能与CD44成功对接，在空间结构及自由能方面具有良好的结合特性，说明S1可能主要通过序列WHXXXX与CD44发生作用。经过四轮筛选，共获得短肽序列7个，后续ELISA法证实了序列S1对CD44具有高亲和力。但是，以纯化蛋白为靶点的ELISA法检验的是噬菌体与固相固定分子的亲和力，而当蛋白质固定于固相表面时，往往会发生空间构型等改变，并且ELISA法较易受到多种因素的干扰。因此，我们又通过细胞免疫荧光法进一步检验阳性噬菌体克隆是否能与膜整合状态的CD44分子相互作用表现出良好的亲和力和特异性。结果再次证实S1-WHXXXXXXQQA对CD44的亲和力和特异性最好。

综上所述，通过噬菌体展示技术筛选S1-WHXXXXXXQQA对CD44的亲和力和特异性最好；其有望成为一个特异性探针，用于胃癌的分子影像学诊断。

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